logo amu logo cnrs

UMR 7286 - Centre de Recherche en Neurobiologie et Neurophysiologie de Marseille

Protocoles

Accueil > Recherche > Équipe T. Brue > Jullien,Nicolas > Protocoles > Southern et Northern en système DIG (Roche)

Southern et Northern en système DIG (Roche)

Considérations générales

Les indications qui suivent complètent et remplacent parfois les protocoles du manuel Roche : DIG Application Manual for filter hybridization.

Utiliser uniquement des gants non poudrés.
Vaisselle propre, rincée extemporanément.
Eau MiliQ uniquement à toute les étapes. (gardée dans un container en verre haute qualité)
Prendre le temps de faire des manips préliminaires pour chaque nouvelle sonde et type d’utilisation (voir optimisation)
Prélever les solutions stocks de façon stérile. Préparer les solutions diluées non stériles extemporanément.

Marquages

Trois protocoles peuvent être utilisés : Random Priming (Roche HighPrime) , marquage par PCR ou transcription in vitro (T3 ou T7 RNA pol)
Jusqu’à présent je n’ai pas obtenu de bons résultats avec les sondes Random Priming en Southern génomique, je ne les ai pas essayé en Northern)

Les sondes utilisées avec succès ont eu des tailles comprises entre 500 et 1000 nucl.
Le %GC doit être idéalement autour de 50%. Si ce n’est pas possible on peut jouer sur les conditions d’hybridations (température) (voir fichier Récapitulatif sondes DIG et remarques Optimisations)

Marquage High-Prime

Il s’agit d’un marquage en “Random priming” avec 1 tube/1 solution. (ref 1 585 606)
Le mix HighPrime de Roche contient sous forme liquide, glycérolée à 50% : l’enzyme (Klenow), les hexanucléotides, les dNTPS dont le DIG-dUTP alkali labile.
Le marquage est très simple et en général reproductible en terme de rendement.

1 µg d’ADN (plasmide total ou mieux insert d’intérét (PCR ou digestion) purifié avec par exemple le kit Nucleospin Extract de Machery Nagel)
dans 16 µl final (eau miliQ ou tampon NE) dans un tube 1,5 ml à capuchon à joint torique.
Bouillir 10 min (dans un bain marie à eau pour une bonne eficacité)
Refroidir dans la glace mouillée
Ajouter 4 µl du mix HighPrime
Incubation O/N à 37°C
Ajout de 30 µl TE (pour pré diluer la sonde)
et éventuellement 0,5 µl EDTA 0,5M (pour arréter la réaction)

Si le fragment de départ est bien pur et n’a pas une composition GC trop exotique le rendement est assez reproductible et on obtient généralement autour de 2 µg de sonde (pour 1 µg d’insert au départ)

La sonde peut être plus précisement dosée par la technique de détection directe sur membrane (voir DIG application manual)

Marquage PCR

Exemple de mix PCR pour l’enzyme Fermentas : (Les autres Taq fonctionnent tout aussi bien, préférer toutefois les tampon contenant du (NH4)2SO4)

5 µl tampon 10x Fermentas avec (NH4)2SO4
5 µl PCR-DIG mix (voir appendice) ou 1 µl dNTP 10mM pour la réaction contrôle
3 µl MgCl2 25 mM Fermentas
2 µl Primer Forward 10 pmol/µl
2 µl Primer Backward 10 pmol/µl
1 µl ADN 50 ng/µl
0,4 µl Taq Fermentas (Cat N° #EP0402)
(Pour les sondes riches en GC : >60% , ajouter 5 à 10% DMSO, qualité culture)
ED qsp 50 µl (31,6 µl ou35,6 µl)

Cycles : (pour 0,5 à 1 kb produit amplifié)

3 min 94°C
20 sec 92°C 20 sec 55°C 45 sec 72°C

35 fois | |18 °C pause | |

Contrôle sur gel : faire migrer 1/50 à 1/10 de la réaction contrôle (sans DIG) et de la sonde DIG en parallèle avec un marqueur quantifié.
Evaluer l’incorporation de DIG : la sonde DIG doit avoir une taille apparente supérieure à celle du contrôle.
Quantifier.
Si sonde OK : utiliser telle quelle ou mieux purifier avec Nucleospin Extract. Reprendre dans 50+30 µl TE (deux centrifugations) et quantifier le produit non dilué dans une Uvette neuve au spectro (et le récupérer !)
Conservation à -20°C (pas besoin d’aliquoter)

Marquage ARN : transcription in vitro

Travailler en conditions RNAse free !

Il faut partir d’un vecteur contenant les promoteurs T3 ou T7 (exemple pBluescript)
Identifier un site unique générant une extrémité 5’ sortante (5’ overhangs) du coté 5’ de l’insert. On utilisera alors le promoteur du coté 3’ de cet insert.
(l’insert se rapporte à la séquence équivalente à ce que l’on doit hybrider, en coupant en 5’ de cette séquence La RNA polymérase génère le brin complémentaire (la sonde) et s’arrête à l’extrémité coupée.)

Digérer 2 à 5 µg d’ADN.
Purifier par phénol/chloroforme et précipitation éthanol ou MacheryNagel Nucleospin Extract
Reprendre dans 20 µl.

Réaction de transcription in vitro
Exemple avec enzymes (T7 ou T3) de Promega.

1 µg ADN linéarisé purifié
2µl DTT 100mM
4µl tampon 5x
2 µl DIG-rNTP mix (voir appendice)
0,5 µl RNAsin
2 µl T7 (ou T3) RNA pol
ED qsp 20 µl

2h37°C
Arrêt réaction avec 0,5 µl EDTA 0,5M
ajout de 30 µl ED pour pré diluer la sonde.

Contrôle : Sur un simple gel agarose BET on peut visualiser l’intégrité de la sonde, on peut aussi estimer le rapport RNA/matrice DNA par comparaison de l’intensité des deux bandes.

Quantification plus précise : suivre le protocole Roche “Direct Detection Procedure”

Gels et transferts

Southerns

Pour des southerns génomiques (Rat, humain) 5 µg par piste sont suffisants.
Voir protocole : ADN génomique : préparation, digestion et quantification.

Migration :
Gel agarose 1xTAE sans BET

Prévoir une piste avec des marqueurs un peu séparée des échantillons(un ou deux puits vides)
A la fin de la migration : découper la piste des marqueurs et la faire tremper 10’ à 1 heure dans du 1xTAE+BET (1 goûte de BET 0,5 mg/ml pour 50 ml)

Traitements gel :
Rincer le gel à l’eau MiliQ
OPTIONNEL : Agitation dans HCl 1/50 1 x 10’. Uniquement si ADN d’intérêt supérieur à 5-10kb.
Rincer le gel à l’eau MiliQ
Agitation dans Tampon de dénaturation gels (voir appendice) 2 x 15’
Rincer le gel à l’eau MiliQ
Agitation dans Tampon de neutralisation gels (voir appendice) 2 x 15’

Transfert :
Membrane Amersham N+ (ou Roche)
ASTUCE : j’écris au crayon gris du coté ou le transfert va se faire et je découpe un bout du coin droit
Montage de Southern du bas vers le haut :

- mèche de Watman 3M dans 20 x SSC posé sur une plaque. La mèche trempe dans des récipients contenant du 20xSSC

- gel (éventuellement retourné : l’ADN est plutôt vers la moitié inférieure du gel)

- membrane pré mouillé Eau MiliQ puis 20xSSC

- 2 feuilles de Whatman 3MM imbibées de 20xSSC
-10 à 20 papiers spéciaux de blotting type Scleicher&Schull : GB004.
-plaque + poids modéré 100-200g

Laisser transferer de 1 à 4 heures (O/N par praticité mais non utile)

Fixation ADN :
Fixation aux UV avec Stratalinker en position Auto Cross Link 1200 µJx100
sur la membrane directement récupéré et humide.
Fixer des deux cotés (diminue le bruit de fond)

Rinçage rapide 2xSSC

Séchage et conservation entre deux Whatman ou enchaîner avec pré hybridation.

Northern

(Lire en complément le chapitre 1 : 4.2.1 du DIG application Manual for filter hybridization)

Contaminations RNAse

Afin d’éliminer les risques de contaminations avec les RNAses une attention particulière sera porté sur l
lavage des plastique cuves et peignes avec NaOH 0,4 M puis H2O
Utiliser H2O milliQ neuve, pas besoin de traitement DEPC.

Quantité d’ARN par piste :
exemple : ARN total de rat (Qiagen RNeasy) 5 µg par puits

Etape1 : Préparation de l’ARN à déposer.
Diluer 5 µg d’ARN dans 50 µl Eau MiliQ
+5 µl NaAc 3M
+125 µl ethanol
15’ glace
15’ 13200 RPM
Culots lavés éthanol 70% puis séché air.
repris dans le tamon de dénaturation voir conditions gels ci-dessous

Deux protocoles de gels  : classique dénaturant formaldhéyde ou natif en 1xTBE.
Le protocole classique permet une estimation plus precise des tailles, mais n’est pas toujours très utile, d’autant que ces gels sont plus long à réaliser, la formaldhéyde contenue dans le gel diminue la capacité de transfert et surtout est toxique et necessite un traitement des déchets coûteux . Les conditions natives (en 1xTBE) reposent sur le fait que l’ARN est dénaturé avant dépôt et reste sous une forme partiellement dénaturé pendant la migration.

Gel formaldhéyde / MOPS

Etape 2a : Dénaturation de l’ARN à déposer

Au 5 µg précedemment précipité ajouter :
16 µl Tampon de Dénaturation ARN pour gel Formaldéhyde (voir appendice)
Dénaturation à 65°C 10’, puis glace
+ 3 µl Bleu ARN (voir appendice)

Etape 3a : Préparation gel pour format midi (90 ml final) (assembler et couler sous une sorbonne !)
(méthode Formaldéhyde 6% final, voir alternative à 2% décrite dans DIG manual)

0,9 g agarose + 65 ml H2O
bouilli, refroidi à 55 °C
+ 9 ml MOPS 10x (autoclavé = couleur jaune normale)
+16 ml Formaldéhyde.

Prévoir une piste avec des marqueurs un peu séparée des échantillons(un ou deux puits vides)
A la fin de la migration : découper la piste des marqueurs et la faire tremper 5-30’ dans du H20+BET (1 goûte de BET 0,5 mg/ml pour 50 ml)

Etape 4a : Migration dans 1xMOPS (sous une sorbonne !)
Pour un midi gel : migration à 85 volts environ 3 heures (bleu du bas au deux tiers)

(Continuer à l’étape 5 : Transfert)

Gel natifs / 1xTBE

Etape 2b : Dénaturation de l’ARN à déposer

Au 5 µg précedemment précipité ajouter :
8 µl H2O milliQ
+ 8 µl 2X Tampon de Dénaturation ARN pour gel natifs (voir appendice) (dénature et sert de tampon de charge, contient du Bleu de bromphenol)
Dénaturation à 65°C 10’, puis glace

Etape 3b : Préparation gel pour format midi (90 ml final)
(méthode Formaldéhyde 6% final, voir alternative à 2% décrite dans DIG manual)

0,9 g agarose + 90 ml 1xTBE
bouilli, refroidi à 50 °C et coulé

Prévoir une piste avec des marqueurs un peu séparée des échantillons(un ou deux puits vides)
A la fin de la migration : découper la piste des marqueurs et la faire tremper 5-30’ dans du H20+BET (1 goûte de BET 0,5 mg/ml pour 50 ml)

Etape 4b : Migration dans 1xTBE
Pour un midi gel : migration à 80 volts environ 2,5 heures (bleu du bas au deux tiers)

Etape 5 : Transfert

(pour les gels formaldéhyde : attention aux déchets : tampon de migration et gel)
Lavage gel à ED plusieurs fois (très important pour gels formaldhéyde, inutile pour gels natifs 1xTBE)
Trempage dans 20 x SSC 1-2x 15’
Montage comme pour le Southern.

Etape 6 : Fixation ARN :
Fixation aux UV avec Stratalinker en position Auto Cross Link 1200 µJx100
sur la membrane directement récupéré et humide.
Fixer des deux cotés (diminue le bruit de fond)

Rinçage rapide 2xSSC

Séchage et conservation entre deux Whatman ou enchaîner avec pré hybridation

Hybridations et lavages

Remarques par rapport au protocole Roche :
L’utilisation de Easyhyb améliore le rapport signal/bruit de fond. Pour certaines sondes il est même le seul qui donne des résultats corrects. Toutefois j’ai eu initialement des difficultés à re-hybrider de façon satisfaisante une membrane après utilisation de ce tampon. Mais dernièrement j’ai obtenu des très bons résultats de réhybridation avec le DIG-dUTP alkali labile et strip alkalin (Aucunes difficultés avec le tampon standard 5xSSC)

Les points cruciaux sont la quantité de sonde, le choix du tampon, la température d’hybridation et la stringence des lavages (force ionique)

tubes ou sacs ? Les deux types de techniques donnent de bons résultats.
J’utilise les sacs VWR ref 9458901 en 150x200mm (utilisés aussi pour les Western). Pour les incubations les sacs sont posés au fond d’une boite plastique à couvercle (ils peuvent être empilés) et agités dans l’incubateur humide (pièce radioactivité ou bio mol).
Pour les tubes : j’utilise les tubes verres à capuchon joint torique qui vont dans la “rôtissoire”. Lorsque la membrane est petite j’utilise un tube 50 ml type Falcon qui est lui même glissé dans le tube en verre (pour pouvoir tenir sur les griffes de la rôtissoire.

Attention : toutes les étapes pré hybridation et hybridation se font avec une membrane pour un sac (ou un tube) . Eventuellement si la sonde le permet (essai préliminaire pour bruit de fond) on peut mettre deux membrane s « dos à dos » dans un sac
Les lavages quand à eux peuvent, sans problème, être effectués plusieurs membranes à la fois dans une même boite. (Veillez toutefois à ce que les membbranes ne se colent pas = suffisament de tampon)

Tableau de référence des températures d’hybridation (et pré hybridation) par type de manip :

sonde cible tampon température d’hybridation
ADN ADN (Southern) Easy hyb Tampon standard 5xSSC 42°C 65°C
ARN ADN (Southern) Easy hyb 50°C
ADN ARN (Northern) Easy Hyb 50°C
ARN ARN (Northern) Easy Hyb 68°C

Pré hybridation
environ 10 ml pour une membrane de 100 cm2 1h pour les techniques EasyHyb. 1à 4 heures pour le tampon standard.

Hybridation :
Sonde ADN 5 à 20 ng sonde par ml milieu hybridation (à tester, voir optimisations)
Faire bouillir la sonde éventuellement un peu diluée dans du TE ou de l’eau- refroidir dans la glace et ajouter au milieu d’hybridation

Sonde ARN : 5 à 100 ng sonde par ml EasyHyb. Je ne fais pas bouillir les sondes ARN : je les dilue directement dans le milieu d’hybridation.

3(sac) à 6(tube) ml pour 100 cm2 de membrane O/N

pour l’hybridation en sac : réutiliser le sac de préhybridation : technique permettant d’éviter la formation de bulles : découper un angle du sac. Eliminer le milieu de pré hybridation, d’abord en laissant couler puis en pressant entre deux papier. Entrouvrir légèrement l’angle coupé et remplir à l’aide d’une pipette, rechasser éventuellement les bulles en faisant glisser le sac contre le rebord de la paillasse. Ressouder.

Lavages :
J’utilise des boites plastiques à parois en angles droits rincées méticuleusement. L’agitation s’effectue dans un bain humide avec une agitation en aller-retour, pas trop vite pour éviter que les membranes ne montent et collent aux parois : régler à l’œil.
Ne pas hésiter à être généreux avec les volumes. Transférer rapidement la membrane entre deux solutions.
Pour ces différents lavages j’utilise toujours la même boite (qui se rince au fur et à mesure)
On peut laver plusieurs membranes en même temps dans la même boite.

Faire deux lavages rapides en 2xSSC/0,1%SDS à température ambiante (2x5’)

Faire deux lavages de 15 à 30 minutes chacun à 68°C avec du 0,5xSSC/0,1%SDS ou 0,2xSSC/0,1%SDS ou 0,1xSSC/0,1%SDS (préchauffés)
(en général pour les Southern j’utilise le 0,5x ou le 0,2x. Pour les Northern le 0,2x ou le 0,1x) (voir optimisations)

Révélation

Les étapes de lavages se font en boites (à température ambiante)
Les étapes de blocage et immuno-réaction se font impérativement en sac soudés.une membrane par sac (voir référence au chapitre Hybridation)
Etre spécialement méticuleux avec la propreté des plastiques.
CSPD ou CDP* voir remarque à la fin du chapitre.

1x2min : Lavage rapide en washing buffer.

1x 30 min : Blocage dans Blocking buffer 10-20 ml/100cm2 en sac

Préparer l’Anticorps : centrifuger à 10000 g , 2-5 min . Prélever l’anticorps en surface et diluer au 1/10 000 dans blocking.
1x 30 min : Anticorps préparé précédemment. 2-10 ml solution/100 cm2 en sac

2x15 min : Washing buffer (en boite bien propre) On peut prolonger éventuellement avec un bain non agité pendant une durée maxi de 2 heures. (peut être meilleur en tout cas pratique au niveau timing).

1x3min : Detection buffer

Placer la membrane, bien égoutté mais sans laisser sécher, sur un sac hybridation ouvert. (l’ADN ou l’ARN au dessus)
Déposer environ 20 gouttes de CSPD-Ready-to-use ou CDP* dispersées sur toute la surface pour une membrane de 100cm2
Refermer le sac (sans le souder) en le plaquant au fur et à mesure de manière à former un film de liquide.
Incuber 5’
Eliminer l’excès de liquide.
Souder modérément (pour éviter les plissures) On aura évidemment pris soin de choisir un morceau de sac sans écriture imprimée sur le dessus.

Pour la révélation en CSPD : Il peut être utile d’accélérer la formation du signal en incubant à 37°C pendant 10 min à 1heure

Durées d’exposition :
Southern génomique : 30 min à plusieurs heures
Northern 2 min à 1 heure

Remarques : Si on constate un bruit de fond qui semble indépendant de l’hybridation : voiles, zones sombres et claires alternées. On peut facilement tester si cela provient de la réaction d’immuno en lavant la membrane à l’eau et en recommencent les étapes précédentes de révélation (blocage,...)
L’utilisateur expérimenté pourra préférer le CDP* (Roche ou Tropix ref MS100R) qui permet une révélation beaucoup plus rapide (2-5x) et qui est aussi plus sensible.

Stripping et réhybridation :
Voir DIG application Manual for filter hybridization 1.8 (page 30)

Les sondes alkali labiles peuvent être « strippées » à l’aide d’un tampon basique (0,2M NaOH/0,1%SDS 2x15 min à 37°C, pour les Southern et en 50%formamide/5%SDS/50mM Tris pH 7,5 2x1heure à 80°C pour les Northerns. (avec toutes les sondes) (voir remarque version 1.4 dans chapitre Optimisations)
J’ai pour l’instant pas assez de recul pour le nombre de réhybridations possibles sans perte de signal

Optimisations.

Prévoir une manip préliminaire pour chaque type de sonde et application.
Faire des mini-southern ou northen avec des charges par piste de l’ordre de 5 µg d’ADN génomique et 1 à 5 µg d’ARN total, représentatifs des échantillons à analyser. Les dot blots peuvent aider mais ne renseignent pas forcément bien sur la sensibilité et la spécificité.
Faire une série de membrane de petites tailles (1cm2 ou plus) avec un ADN (ou ARN) témoin
Northern en incluant une ou plusieurs membranes sans matériel transféré.
Faire des variations du protocole en combinant les différents points (par ordre de priorité)
Pour les Southern génomiques :
Quantité de sonde : autour de 20 ng/ml (0 à 50)
Type de tampon : Easyhyb ou Tampon standard (si le tampon standard fonctionne, c’est plus économique
Température d’hybridation : autour de la température standard (voir tableau titre hybridation) : par exemple pour une sonde ADN riche en GC on peut monter jusqu’à 50°C en Southern sur EasyHyb (à la place de 42°C°, inversemment penser à baisser la température d’hybridation si le signal est faible (par exemple j’ai obtenu des bons résultats en hybridant certaines sondes ARN en Northern à 55°C à la place de la température « standard » de 68°C)
Force ionique des lavages : essayer les trois tampons 0,5x, 0,2x et 0,1xSSC/0,1%SDS.

Si dans ces conditions le signal reste toujours non spécifique ou bruit de fond important : essayer un autre type de sonde : une autre séquence ou une autre méthode de marquage. (Une sonde ADN peut ne pas marcher du tout et le même fragment en synthèse ARN peut donner de très bons résultats : voir “ma” sonde Hygro.)

Si par contre le signal est très (trop) fort on peut recommencer avec moins de matériel sur les membranes.

Remarque version 1.3 : Actuellement pour les Southerns génomique, je fais les manips dans des conditions standards avec des sondes PCR. Si ça ne donne rien de bon, je privilégie le changment de zone couverte par la sonde quand c’est possible, plutot que d’essayer de trouver les conditions « les moins pires » avec une sonde qui s’annonce difficile à faire fonctionner.
Remarques version 1.4 : Lorsque le signal est faible (mais propre) j’ai confirmé que souvent le passage d’une sonde PCR à une sonde ARN améliore très sensiblement le signal.
J’ai aussi confirmé que la réhybridation des Northern ne marche pas  ! : plus aucun signal dès la deuxième hybridation avec ou sans stripping (qui est d’ailleurs très peu efficace) (cette remarque ne s’applique qu’aux Northern, les Southern quand à eux se réhybrident très bien)


APPENDICES :


Préparations des tampons

Tampons Composants Quantité/volume
10 x MOPS (1l) MOPS (poudre) EDTA 0,5 M Acétate de Sodium pH7 3M ED qsp 1 litre (autoclaver : vire au jaune) 41,2 g 20 ml 17 ml
1xDénaturation ARN/gels formaldhéyde (10 ml) Formamide déionisée Formaldéhyde 37% 10xMOPS ED qsp 10 ml (conservation à -20°C) 5 ml 1,75 ml 1 ml 2,25 ml
2xDénaturation ARN/gels natifs 2xTBE (pH 8,3) 13% ficoll (w/v) 0,01% bleu de bromophénol 7 M urée
6xTampon de charge ARN (10ml) xylène cyanol Bleu de Bromophénol EDTA 0,5M glycérol 100% ED qsp 10 ml 15 mg 15 mg 200 µl 5 ml
Dénaturation gels (500 ml) NaOH pastilles NaCl ED qsp 500 ml, filtration 0,2 10 g 43,8 g
Neutralisation gels (500 ml) (0,5 M Tris pH 7,5 ; 1,5M NaCl) Tris-HCl (poudre) Tris-base NaCl ED qsp 500 ml Filtration 0,2 µ 31,75 g 5,9 g 43,8, g
Tampon Tris pH 7,5 10xconcentré = base révélation DIG =alternative au 0,1M Maleic (500 ml) Tris-HCl (poudre) Tris-base NaCl ED qsp 500 ml Filtration 0,2 µl autoclavé 63,5 g 11,8 g 43,83 g
1x Tampon révélation DIG (ou tampon Tris pH 9)

Il est possible aussi de le concentrer 10x comme solution stock à diluer dans l’eau au moment de l’emploi.
Tris-HCl (poudre) Tris-base NaCl ED qsp 500 ml Filtration 0,2 µl autoclavé 0,76 g 5,47 g 2,92 g
10 % blocking Blocking Reagent Roche Cat N° 1 096 176 (= caséine purifié) 5 g dans Tampon Maleic (O,1 M Maleic ; 0,15M NaCl ; pH 7,5) Dissolution par deux pulses au micro-onde et agitation flacon. Aliquoté, -20°C

Attention : le blocking « caille » dans le tampon Tris au moment de la dissolution par chauffage
1% blocking dans tampon tris Tampon Tris pH7,5 1 x Blocking 10% (dilué à partir de tampon 10x) 1/10 volume final
Tampon Washing Tampon Tris pH 7,5 1x Tween 20 dilué 1/10 à partir de tampon 10x) 300 µl pour 100 ml final
10 % N-Lauryl Sarcosine (10 ml) N-Lauryl Sarcosine 1 g ED qsp 10 ml Filtré 0,2 µm
Tampon standard d’hybridation (100 ml) 20 x SSC 10 % N_Lauryl Sarcosine 10 % SDS 10 % Blocking 0,5 M EDTA 25 ml 1 ml 0,2 ml 10 ml 400 µl ED qsp 100 ml
DIGAlkali labile Strip Solution (500 ml) NaOH (pastilles) SDS 10% 4 g 5 ml ED qsp 500 ml

Mix dNTP DIG pour PCR :

Composition finale Solutions mères Volumes pour 25 µl final
2 mM dATP 2mM dCTP 2mM dGTP 1,6 mM dTTP 0,4 mM DIG dUTP alkali labile 100 mM dATP (Promega) 100 mM dCTP 100 mM dGTP 100 mM dTTP 1 mM (Roche Cat N° 1 573 152) 0,5 µl 0,5 µl 0,5 µl 0,4 µl 10 µl

ED qsp 25 µl = 13,1 µl

- 

Le CRN2M en chiffres

  • 20 Chercheurs
  • 19 Enseignants Chercheurs
  • 39 ITAs et IATOs
  • 3 Post-Docs
  • 5 Docs
  • 4 Étudiants de Master

    Ils nous font confiance

  • logo amu
  • logo cnrs
  • logo inserm
  • logo AP-HM
  • logo Galderma
  • logo Ipsem
  • logo Novartis
  • logo Pfizer
  • logo Fédération pour la Recherche sur le Cerveau
  • logo Fondation pour la Recherche Medical en France
  • logo IBiSA
  • logo Europe programme FEDER
  • logo Agence Nationale de la Recherche